肉制食品摻假的情況主要是以低價肉替代高價肉，從而達到降低成本賺取差價的目的。因此雞、鴨等肉制品的摻假情況較少，而牛、羊、驢等肉制品的摻假現(xiàn)象較多，特別是驢肉和羊肉摻假情況尤為嚴重。實驗室最近購買了幾種肉制品，準備檢測其中的摻假情況，接下來就讓小新帶大家看看情況到底怎么樣吧。

一、 實驗目的

對牛肉制品進行動物源性檢測，判斷其所含成分。

二、 實驗材料

1. 肥牛卷（杭州達泰食品有限公司）、動物組織DNA試劑盒(Simgen Cat.No.3101050)，牛源性DNA熒光PCR檢測試劑盒(Simgen Cat.No.7801050)，雞源性DNA熒光PCR檢測試劑盒(Simgen Cat.No.7805050)，豬源性DNA熒光PCR檢測試劑盒(Simgen Cat.No.7804050)，鴨源性DNA熒光PCR檢測試劑盒(Simgen Cat.No.7806050)，1.5 ml離心管若干，一次性手術刀。

2. 臺式小量離心機（eppendorf Centrifuge 5415D）

旋渦振蕩器(杭州米歐儀器有限公司XH-C)

電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）

超微量分光光度計（Simgen Cat.No.Sim-100）

超微量電子天平（福州華科電子儀器有限公司 TP-213）

電泳儀（北京六一儀器廠 DYY-6C型）

ABI PRISM®7500熒光PCR儀

三、 實驗方法

（一）DNA提取方法

1. 用手術刀切取25 mg肥牛卷，再用刀尖將組織剁成勻漿狀，轉移組織到一個1.5 ml離心管中。

2. 加入20 μl蛋白酶K貯存液，再加入180 μl 56 ℃預熱的Buffer AT，旋渦振蕩數(shù)秒使組織勻漿分散開來。

3. 56℃水浴30分鐘，期間旋渦振蕩數(shù)次幫助組織溶解。

4. 加入200 μl Buffer SL，旋渦振蕩約15秒混勻。將離心管置于70 ℃水浴10分鐘。

5. 加入200 μl無水乙醇，旋渦振蕩約15秒混合均勻。

6. 吸取步驟5中的溶液加入到核酸純化柱（純化柱置于2 ml離心管中）中，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA(已加入無水乙醇), 蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

8. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WB(已加入無水乙醇), 蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

9. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，13200 rpm離心2分鐘。

10. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱中加入100 μl 56 ℃溫育的Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒得到DNA。

 （二）熒光PCR操作方法

1. 按照下表配置熒光PCR反應體系：

按5管的用量配置好PCR反應混合液，按每管35 μl的量將反應混合液分裝到八聯(lián)管中。

2. 取10 μl提取的DNA，加入90 μl的 ddH₂O混合均勻，將其稀釋10倍作為DNA模板。

3. 依次在PCR反應混合液中平行加入4.2 μl的DNA模板、ddH₂O（陰性對照）、陽性對照（牛DNA、豬DNA、雞DNA、鴨DNA），蓋上管蓋，簡短離心，最后于ABI PRISM®7500熒光PCR儀中進行熒光定量PCR。實驗參數(shù)如下：（95℃ 1 min;95℃ 10s；60℃ 30s）×40 cycles

四、 實驗結果

在超微量分光光度計上用Buffer TE調零，測量洗脫下來的DNA，結果如下：

2.在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl提取到的DNA，電泳20分鐘，結果如下：

3.熒光PCR擴增結果如下：

五、 討論與分析

1. 由超微量分光光度計測量結果可知，從肥牛卷中成功提取到了一定量的DNA，其中A260/280比值偏高，考慮到肥牛卷是加工產品，RNA還存在的可能性極低，推測是降解的DNA。結合電泳圖可知，提取的DNA確實存在嚴重的拖尾情況，不過主條帶清晰明顯，不影響后續(xù)的PCR擴增。

2. 由熒光PCR檢測結果可知，此款肥牛卷中除了檢測到牛源性成分外，還檢測到了豬源性成分、雞源性成分和鴨源性成分。但是豬源性成分、雞源性成分和鴨源性成分的CT值分別為：32.915，32.997、34.823，35.013、34.923，34.891，相比牛源性成分檢測到的數(shù)字要大13-14個CT值，推算下來濃度差距達到將近一萬倍，摻假從動機上分析可能性不成立。

3. 由于CT值接近35被稱為臨界陽性值（即只有幾個DNA分子檢測到的CT值），所以我們推測這些非牛源的DNA來源最大的可能性是肉類加工過程中的檢疫、運輸、包裝等流程所摻入的，杭州達泰食品有限公司提供的肥牛卷沒有摻假行為。