分子生物學實驗中，質粒提取是最常見的也是非常重要的一項實驗，是后續(xù)實驗的基礎。同學們在質粒提取過程中最煩惱的問題大概就是質粒提取的濃度低，Simgen實驗室有著20幾年質粒DNA提取的經(jīng)驗，現(xiàn)在結合各個案例作一個分析總結，供大家做參考。

一、客觀因素：

1） 建議認準市場上續(xù)存了10年以上的質粒試劑盒生產(chǎn)廠家，不要購買近幾年新推出試劑盒的品牌。

出乎很多人的意料，一個質量穩(wěn)定的質粒DNA提取試劑盒取決于試劑盒中配套的純化柱，而不是試劑本身。柱子穩(wěn)定性的問題，做核酸提取試劑盒的廠家?guī)缀醵挤^船（國際大牌QI**EN,曾經(jīng)的杭州維特潔生化、Ta**ra、OM**A等等）。最后成熟的產(chǎn)品采用了兩條路線，一條是我們Simgen公司一直堅持的路線，把柱子的穩(wěn)定性做好，把困難和麻煩留給自己。另一條則是擺爛路線，就是Tia**en，Aid**b等公司的質粒試劑盒，為了解決柱子穩(wěn)定性的問題，額外增加了用平衡液處理柱子的一個操作步驟----把麻煩留給用戶。當然這還算好的，至少質粒DNA還能提取到，最糟糕的就是一些新推出質粒提取試劑盒的公司，試劑盒剛開始用的時候提取質粒DNA的濃度還不錯，幾個月后，質粒DNA就幾乎提取不到，或者提取到的濃度極低了。所以購買質粒提取試劑盒的時候，建議購買品牌已經(jīng)成立10年以上的公司的產(chǎn)品。

2） 質粒拷貝數(shù)低

雖然寫了這個因素，但總體來看，這個因素還是比較少的，除了像BAC，PAC之類的大質粒之外。有一個因素需要提示一下：同樣是一個pUC-19的質粒，空載體pUC-19接近于3K的長度，重組pUC-19質粒如果是插入了一個3K的基因，那么在其他條件相同的情況下，提取到重組的pUC-19質粒DNA的濃度會比空載體pUC-19質粒DNA濃度高一倍左右。具體原因請大家自行腦補。

二、主觀因素： 

1) 細菌的接種（最容易犯的通?。?/span>

首先提兩個問題：一、我們培養(yǎng)細菌的時候加入的抗生素是否會直接殺死不帶質粒的大腸桿菌？二、我們做質粒轉化后的平板中的單克隆菌落中，是否只含有一種攜帶質粒的大腸桿菌？

如果你覺得上面兩個問題的答案都是肯定的，那問題就比較大了，因為有了上述兩項錯誤的認知，它會直接指導同學們在細菌接種中跟進各種錯誤的操作。

問題一的答案：抗生素通常是阻止了細菌正常的生理活動，導致的結果是不能繁殖，而非直接殺死細菌。以最常用的氨芐青霉素為例，其機理是阻礙細菌細胞壁的合成，阻礙細胞壁合成的結果，并不等于直接殺死。大家可以回顧一下微生物學中的內容，是不是有一種L型細菌，沒有細胞壁也能活得好好的。

第二個問題的答案和問題一的答案緊密相關：雖然平板中的單菌落是攜帶質粒DNA的大腸桿菌繁殖出來的，但是根據(jù)問題一的答案，你還認為單菌落之外的培養(yǎng)基上就沒有活的細菌了嗎？大家腦補一下微觀世界中的場景：這些沒攜帶質粒的細菌都在等待機會，等待抗生素失效后重新繁殖。等不到怎么辦呢？找個大腿抱一下，跟著攜帶質粒的細菌一起繁殖唄，所以答案二是單克隆菌落中是混有不攜帶質粒的大腸桿菌的。

有同學會問：有證據(jù)嗎？那請看圖片（估計很多同學也觀察到過類似的現(xiàn)象）：

這是一個轉化實驗后涂的平板在2-8℃冰箱中放置幾天后發(fā)生的變化：原來沒有轉化子的位置出現(xiàn)了很多細小的菌落，就是因為抗生素在緩慢地失效，一些等到機會的細菌便開始繁殖了。當然這些細小的菌落圍繞著大菌落的會更密集，為什么呢？這是因為大菌落中的細菌在分泌分解抗生素的酶，大菌落周圍的抗生素都被分解了，小菌落借著大菌落提供的抗性資源在生長繁殖。

了解上述背景知識后，我們來解釋一種同學們最容易犯的細菌接種問題：引用Simgen質粒提取試劑盒的說明書內容要求：從新鮮培養(yǎng)的平板中挑取一個單克隆菌落，接種到3-5 ml含對應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃，劇烈振蕩培養(yǎng)12-16小時。

有些想偷懶的同學就會想，每次接種細菌都要重新在平板上劃線多麻煩，干脆留一點培養(yǎng)物做種子多簡單？在這里，小新必須點名批評醫(yī)學院和藥學院的同學，為什么他們最喜歡這么干？因為他們經(jīng)常會培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)細胞的時候，留一些養(yǎng)好的細胞接種那可是標準的操作步驟哦。而培養(yǎng)細菌時這么操作的后果就是提取到的質粒DNA濃度越來越低。

具體原因解釋如下：因為初代轉化出來的單克隆菌落中混有不帶質粒的大腸桿菌，假如第一代細菌培養(yǎng)物中只含有10%不含質粒的大腸桿菌，取這個菌液再次接種后，不含質粒的大腸桿菌很可能會提高到20%。為什么呢？因為含質粒的大腸桿菌需要額外復制質粒DNA，并且還要表達生產(chǎn)分解抗生素的酶，工作辛苦長得慢，不帶質粒的大腸桿菌靠享用了有質粒的細菌生產(chǎn)的酶帶來的好處，摸魚混日子自然長得快了。當然也不排除有些含質粒的細菌發(fā)現(xiàn)丟掉質粒也能生長得挺好（其實是因為別的含質粒的細菌在分解抗生素的原因），身體里懷著質粒寶寶就是個累贅，在繁殖的過程中干脆把質粒丟棄了，變回了不含質粒的普通大腸桿菌。所以，只要你連續(xù)用菌液接種幾代，雖然細菌看上去正常生長，但是培養(yǎng)物中含質粒的細菌其實會越來越少，導致提取到的質粒DNA濃度越來越低。

這些同學在反饋問題時通常還都會加上一句：你們的產(chǎn)品一開始用提取到的DNA濃度挺高的，然后濃度越來越低，你們的產(chǎn)品好像很快就失效了…….

我們有個投訴的用戶寄過來一些培養(yǎng)好的菌液，直接提取發(fā)現(xiàn)質粒DNA濃度確實很低，但是當我們把提取到的質粒DNA重新轉化了一下，然后挑單菌落提取質粒DNA，濃度提升了10倍以上！ 所以，如果你開始懷疑你保留的菌種中質粒DNA可能有丟失的情況，最簡單的方法就是把質粒DNA重新轉化一次，問題可能很快就解決了。

2) 注意無菌操作

初次做分子生物學實驗的同學通常是謹慎小心的，但到了后期就開始大大咧咧了，因為酶切、PCR之類的都不需要無菌操作。然后呢接種細菌也開始無所謂了……我們碰到過浙江大學的一個實驗室的投訴，他們說用我們的試劑盒提取質粒DNA濃度變低了，還特別提到可能是Buffer II有問題，因為溶菌后溶液不夠透明。由于同一個批次的產(chǎn)品沒有用戶投訴，我們就派了技術支持上門，結果帶回來個驚天大瓜：他們實驗室統(tǒng)一的認知是不需要在超凈臺接種細菌，理由是培養(yǎng)基里已經(jīng)添加了抗生素了……what?! 估計他們忘了一點，最常用的氨芐青霉素和卡那霉素只對細菌有效，對真菌是無效的啊 ！

       總結一下：Buffer II只能溶解革蘭氏陰性菌（革蘭氏陽性菌也不能溶解），如果發(fā)現(xiàn)用Buffer II裂解細菌時不夠透明，比較渾濁，就要懷疑培養(yǎng)的細菌中已經(jīng)混有真菌了；如果加入Buffer II裂解細菌時不僅渾濁，甚至沒有粘稠感，那更糟糕，證明培養(yǎng)物中根本沒有大腸桿菌，或許挑取接種的是平板上一個真菌的菌落。

3) 從過多的細菌中提取質粒DNA

在一定范圍內，提高細菌用量是能提高質粒DNA回收量的。但是如果使用了過量的細菌，會導致質粒DNA釋放得不夠充分，最后質粒DNA的回收量反而下降。（感興趣的同學可以看一下之前的文章“質粒DNA提取時加大菌液用量會有什么影響？”）當然，不同的菌種，不同的培養(yǎng)基條件下細菌生長的密度都是不同的，那么我們怎么粗略地判斷是否使用了過量的細菌呢？

第一種情況：如果加入裂解液Buffer II裂解細菌時裂解產(chǎn)物非常粘稠，像鼻涕一樣粘稠，翻轉離心管時都難以流動了，可以判斷為使用了過量的細菌。

第二種情況：加入中和液Buffer N8（也包括Buffer III、Buffer N3）后形成的沉淀物難以收縮并分散開來，離心后沉淀不到底部，甚至呈現(xiàn)為膨脹的懸浮狀態(tài)，也可以判斷為使用了過量的細菌。

我相信很多同學加大細菌的用量無非是想多提取一些質粒DNA，其實改變培養(yǎng)基的組分可能是更簡便的提高單位體積細菌培養(yǎng)物中質粒DNA含量的方法：將LB培養(yǎng)基中的NaCl含量提高到10 g/L，每毫升LB細菌培養(yǎng)物的質粒DNA得率能提高2 μg左右。

4) 請將提取到的質粒DNA電泳驗證

雖然大多數(shù)情況下，提取到的質粒DNA用分光光度計測個濃度和純度就可以進行下一步實驗了。但是如果你觀察到OD₂₆₀/ OD₂₈₀高于1.9的時候，必須要考慮質粒DNA中殘留的RNA已經(jīng)影響到質粒DNA濃度的定量了，所以請務必用電泳驗證下質粒DNA的濃度。

我們緊跟問題3）中使用過量細菌提取質粒DNA后可能產(chǎn)生的問題：也許正是因為有同學加大細菌用量后測得的濃度有所提高，就變本加厲持續(xù)加大細菌的使用量了。但他們很快就會發(fā)現(xiàn)OD₂₆₀/ OD₂₈₀都快接近2.0了。這種現(xiàn)象背后真正的原因是菌體釋放的RNA已經(jīng)超出Buffer I中RNase A能消化的上限了，沒有被消化的RNA片段太長，就會和質粒DNA一起吸附到純化柱上，再一起洗脫下來。這時候電泳驗證一下，就會發(fā)現(xiàn)，雖然測OD₂₆₀推算出質粒DNA的濃度挺高，但電泳會發(fā)現(xiàn)質粒DNA條帶并沒有變亮甚至變暗了，同時在溴酚藍附近出現(xiàn)了比較明顯的亮斑，這些亮斑就是殘留的RNA，它會極大地提高OD₂₆₀的吸收峰值。

我們看一張電泳圖 ： 

這是有效期內的Buffer I對照加入RNase A的時間已經(jīng)超過6個月的Buffer I提取5 ml同一菌液中的質粒DNA后的電泳圖。（需要備注的是，為了顯示出殘留的RNA，我們特別上樣了8 μl提取的質粒DNA，并減少了電泳時間。如果上樣量少，或者電泳時間太長，可能就觀察不到這些殘留的RNA了。）電泳看上去質粒DNA亮度差不多的質粒DNA，可分光光度計測得的數(shù)據(jù)完全不同，見下表：

所以，我們可以得出結論：僅僅這些降解的RNA亮斑就貢獻了接近100 ng/μl 虛高的質粒DNA濃度。我們可以想象一下，新買的質粒試劑盒剛加入RNase A，提取的質粒DNA中沒有RNA殘留，而之前使用的老試劑盒，RNase A加入時間過久，提取的質粒DNA中有RNA殘留，導致新試劑盒提取的質粒濃度遠低于老試劑盒，因此讓你有了新買的試劑盒效果不行的錯覺，但是實際上兩者提取到的質粒DNA是差不多的。

最后我們提示一下在哪些情況下非常有必要用電泳驗證質粒DNA的真實濃度：

A. 提取到的質粒DNA OD₂₆₀/ OD₂₈₀高于1.9

B. 試劑盒的Buffer I中加入RNase A的時間接近或超過6個月了

C. 冬季環(huán)境溫度較低，會導致RNase A活性降低；或者在現(xiàn)象上已經(jīng)可以判斷出使用了過量的細菌的情況下

5) Buffer II有沉淀

如果Buffer II中的沉淀物（是SDS）沒有溶解就使用，結果會怎樣？

我們分別使用有沉淀產(chǎn)生的Buffer Ⅱ、水浴后沉淀消失的Buffer Ⅱ和Buffer NⅡ提取3 ml的同一細菌培養(yǎng)物，提取效果對比如下：

1、2為使用有沉淀產(chǎn)生的Buffer Ⅱ的提取結果；3、4為新配方Buffer NⅡ的提取結果；5、6為水浴后沉淀消失的Buffer Ⅱ的提取結果。

再結合電泳圖看一下：

結合分光光度計測量結果和電泳圖，可以得知低溫情況下Buffer Ⅱ析出白色沉淀時，若一時疏忽沒有發(fā)現(xiàn)就直接使用，那質粒得率將會大幅度降低。因此溫度較低時進行質粒提取實驗的同學一定要注意觀察Buffer Ⅱ是否出現(xiàn)沉淀。

看到這有同學會問了，那個Buffer NⅡ是什么？這是我們Simgen特意研發(fā)推出替代Buffer II的新產(chǎn)品——在0~10℃的低溫條件下依舊不會產(chǎn)生沉淀，提取效果與沉淀溶解的Buffer Ⅱ提取質粒效果相當，能完美替代Buffer II，解決各位同學的后顧之憂。目前這款產(chǎn)品還在測試階段，后續(xù)將會逐步更新到各款質粒提取試劑盒中。