之前小新向大家隆重介紹了一款提取植物總RNA的強(qiáng)效產(chǎn)品——高多糖多酚植物總RNA試劑盒，這款試劑盒通用性極強(qiáng)，幾乎可以提取任何植物樣本，受到了很多植物研究人員的喜愛(ài)。但是世上萬(wàn)物沒(méi)有十全十美的，今天我們用實(shí)驗(yàn)自爆這款明星產(chǎn)品的缺陷。

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驗(yàn)證Simgen高多糖多酚植物總RNA試劑盒存在的產(chǎn)品缺陷。

實(shí)驗(yàn)材料：

?？巳R爾（一種綠色月季花，由浙江農(nóng)林大學(xué)友情提供）、研缽、液氮

高多糖多酚植物總RNA試劑盒（Simgen Cat.No.5103050）

超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim100）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型） 

實(shí)驗(yàn)方法：

1 a. 稱取250 mg花瓣放入研缽中，加入液氮研磨成粉末狀。加入3 ml已加入β-巰基乙醇的Buffer RCT，繼續(xù)研磨直至呈勻漿狀，分別吸取650 μl勻漿液（按50 mg組織換算成50 μl勻漿物+600 μl裂解液計(jì)算）到4個(gè)RNase-free的1.5 ml離心管中，編號(hào)1、2、3、4，分別向1、2兩管中加入1 μl RNase A；

 b. 稱取600 mg花瓣放入研缽中，加入液氮研磨成粉末狀。加入1.8 ml已加入β-巰基乙醇的Buffer RCT，繼續(xù)研磨直至呈勻漿狀，分別吸取800 μl勻漿液（按200 mg組織換算成200 μl勻漿物+600 μl裂解液計(jì)算）到2個(gè)RNase-free的1.5 ml離心管中，編號(hào)5、6；

2. 加600 μl Buffer EX，用力混合均勻后離心5 min；

3. 吸取350 μl上清于潔凈的1.5 ml管中，加入350 μl Buffer K混合均勻，混合液全部轉(zhuǎn)移到過(guò)濾柱中離心；

4. 棄過(guò)濾柱，向?yàn)V液中加入700 μl 70％乙醇混合均勻，將混合液分兩次加入核酸純化柱中，離心棄濾液；

5. 依次加入500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR洗滌；

6. 14000 rpm空離1 min去除殘留乙醇；

7. 將核酸純化柱置于潔凈的RNase-free的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入50 μl RNase-Free Water，室溫靜置1 min，離心洗脫得到RNA。 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、在超微量分光光度計(jì)上用試劑盒的RNase-Free Water調(diào)零，測(cè)量洗脫下來(lái)的RNA，結(jié)果如下：

1、2是50 mg加了RNase A的花瓣組織提取的RNA；

3、4是50 mg花瓣組織提取的RNA；

5、6是200 mg花瓣組織提取的RNA。

2、在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl洗脫的RNA進(jìn)行電泳，結(jié)果如下：

分析與討論： 

1. 從樣品編號(hào)3、4測(cè)得的濃度可以發(fā)現(xiàn)，50 mg?？巳R爾花瓣就提取到了大約17 μg的RNA，說(shuō)明這種花瓣的RNA含量非常高。而同樣是50 mg的花瓣，加入了1 μl RNase A的1、2測(cè)得的濃度只有個(gè)位數(shù)，相當(dāng)于沒(méi)有，這應(yīng)該是RNA都被降解掉了。

2. 當(dāng)樣本量增加到200 mg時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)只提取到了大約33.5 μg的RNA，只增加了大約2倍的量，并沒(méi)有按照體積的增量相應(yīng)地增加4倍。

3. 從電泳圖可以看到，50 mg花瓣提取的RNA條帶清晰完整，加了RNase A的RNA確實(shí)都降解了，完全沒(méi)有看到條帶。而200 mg花瓣提取的RNA則存在明顯的降解情況。 

綜上所述，證明了Simgen高多糖多酚植物總RNA試劑盒對(duì)有RNase A使用的環(huán)境非常敏感，究其原因是裂解液Buffer RCT不像Trizol試劑一樣含硫氰酸胍，不能像Trizol試劑一樣有效地變性滅活RNase A。

其次，在沒(méi)有RNase A污染的正常提取過(guò)程中，Buffer RCT采用的策略是在RNA分子周圍形成保護(hù)層，防止其被剪切斷裂。但如果樣本中的RNA含量太高，Buffer RCT就不能保證在所有的RNA分子周圍都形成有效的保護(hù)層，導(dǎo)致最后提取到的RNA出現(xiàn)部分降解的情況。

最后我們提醒用戶使用Simgen高多糖多酚植物總RNA試劑盒時(shí)必須注意以下兩點(diǎn)：

1. Simgen高多糖多酚植物總RNA試劑盒對(duì)RNA酶污染非常敏感，千萬(wàn)不要在使用RNA酶（比如提取質(zhì)粒DNA）的實(shí)驗(yàn)室提取RNA，包括用過(guò)RNA酶的移液器也不能用作提取RNA。

2. 精確控制樣本用量，切忌太隨意。使用Simgen高多糖多酚植物總RNA試劑盒時(shí)，寧愿少用樣本，也不要多用樣本。對(duì)于嫩葉、嫩芽等RNA含量高的樣本，用量應(yīng)控制在100 mg以內(nèi)，只有RNA含量低的樣本（比如土豆，水果等）才推薦用到200 mg的組織，否則提取的RNA可能會(huì)出現(xiàn)降解現(xiàn)象。