小新作為技術(shù)員，在進(jìn)行SYBRGreen熒光PCR時(shí)也會(huì)經(jīng)常碰到和顧客們一樣的問(wèn)題，好好的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果熒光跑完了會(huì)出現(xiàn)一些奇怪的熒光曲線(xiàn)，那么面對(duì)這樣的結(jié)果，我們應(yīng)該怎么來(lái)分析呢？接下來(lái)，小新帶大家看一些“不規(guī)矩”的熒光曲線(xiàn)，并一起來(lái)分析分析原因。

首先來(lái)看這種熒光曲線(xiàn)：

看到這一堆亂七八糟的線(xiàn)是不是就頭大？實(shí)際上這些樣本是存在一定的濃度梯度的【小新是按照10倍、100倍、1000倍這樣稀釋的】，然而這些樣本在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看不出相應(yīng)的差異，并且有些線(xiàn)在PCR后期會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這樣的結(jié)果基本上顯示了樣本DNA濃度過(guò)高，因?yàn)闊晒?/span>PCR儀檢測(cè)到熒光存在一個(gè)閾值【小新采用的這款儀器，它開(kāi)始能夠接受的熒光起始值圍繞在15左右】，如果DNA濃度過(guò)高的話(huà)，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增的前面幾個(gè)循環(huán)，儀器就已經(jīng)開(kāi)始能夠檢測(cè)到熒光，導(dǎo)致所有的曲線(xiàn)全都堆積在一起，無(wú)法分開(kāi)。面對(duì)這種情況，小新建議大家多稀釋一些梯度【擴(kuò)大稀釋倍數(shù)也可啊】，努力做到讓曲線(xiàn)分開(kāi)。

第二種曲線(xiàn)乍看上去非常正?！?/span>

有木有覺(jué)得很完美？？？?。?！

但是如果小新告訴大家，這兩條線(xiàn)其實(shí)有一個(gè)是陰性對(duì)照，你們是不是就懵圈了呢？

實(shí)際上的樣本是這樣的！

肯定有小伙伴說(shuō)你肯定在逗我吧！其實(shí)出現(xiàn)這種線(xiàn)的情況并不少見(jiàn)，多存在于熒光PCR的引物測(cè)試過(guò)程中。由于引物設(shè)計(jì)的不完美，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)引物二聚體。當(dāng)然除了看熒光曲線(xiàn)以外，還可以用融解曲線(xiàn)為佐證（不知道啥是融解曲線(xiàn)的小伙伴可以自行百度，度娘解釋的很清楚喲?。?。

從圖上就可以明顯看出陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照的峰值并不在一起，也就是說(shuō)陰性對(duì)照出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，這個(gè)陰性的峰值就是引物二聚體的融解溫度。所以小伙伴們?cè)谧稣降臒晒?span >PCR實(shí)驗(yàn)之前，一定要記得進(jìn)行引物測(cè)試，以免遇到這種情況哦！

最后一種曲線(xiàn)就相對(duì)簡(jiǎn)單的多了

接下來(lái)再看看它們的融解曲線(xiàn)（毫無(wú)章法的任性曲線(xiàn))

大部分小伙伴看到這種曲線(xiàn)的第一反應(yīng)就是：這明顯是陰性對(duì)照嘛！是的，圖上這三條曲線(xiàn)的樣本均為陰性測(cè)試但是這三條線(xiàn)在結(jié)尾還是出現(xiàn)了起線(xiàn)，我們?cè)谝话闱闆r下也視為陰性，那么它出現(xiàn)起線(xiàn)的主要原因是什么呢？由于擴(kuò)增體系中Mg離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低,及PCR循環(huán)次數(shù)等多重因素都會(huì)導(dǎo)致這種現(xiàn)象的發(fā)生。其次酶量過(guò)多有時(shí)也容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

好啦，今天的小新課堂講述了好多新的科普知識(shí)，希望小伙伴們?cè)趯W(xué)習(xí)的過(guò)程中也能夠和小新多多交流，小新歡迎大家來(lái)信對(duì)小新課堂進(jìn)行評(píng)價(jià)和指導(dǎo)！（畢竟小新也是個(gè)愛(ài)好學(xué)習(xí)的好孩紙！這是小新的郵箱：technical@simgen.cn 記得給我來(lái)信哦。么么噠！