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唾液樣本不加保存液能在室溫存放多久

作者:新景實(shí)驗(yàn)室
版權(quán)說明:本文系原創(chuàng)文章 轉(zhuǎn)載請標(biāo)注出處和本文鏈接

前段時(shí)間有客戶詢問唾液采集后在不加保存液的情況下,唾液中的DNA可以在室溫放多久而不降解。為了解答客戶的疑問,于是小新測試了唾液在室溫放置不同時(shí)間段提取DNA效果情況,以及唾液與唾液保存液混合后在不同時(shí)間段提取DNA的效果。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

測試唾液樣本在室溫放置不同時(shí)間對唾液DNA的影響及唾液保存液對唾液中DNA的保存效果


二、實(shí)驗(yàn)材料

1. 新鮮采集的人唾液、1. 5 ml離心管若干、2 ml離心管若干

2. 唾液DNA純化試劑盒(Simgen Cat.No.3501050、唾液DNA保存液(Simgen Cat.No.3522050

3. 臺式離心機(jī)(eppendorf centrifuge 5415D)、旋渦振蕩器(越新儀器,XH-C)、超微量分光光度計(jì)(Simgen Cat.No.sim-100、電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-6C型)

 

三、 實(shí)驗(yàn)方法

整個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度波動范圍22~28。

1. 用潔凈的一次性水杯收集唾液:

1a. 轉(zhuǎn)移400 μl唾液到一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中(分別在室溫放置0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、4小時(shí)、7小時(shí)以及24小時(shí)),加入400 μl Buffer L5,劇烈搖晃離心管35次,再旋渦振蕩30秒混勻。最高速(≥12000 rpm)離心1分鐘。

1b. 轉(zhuǎn)移400 μl唾液到一個(gè)潔凈的2 ml離心管中,再加入400 μl唾液DNA保存液混合均勻(分別在室溫放置4小時(shí)、7小時(shí)以及24小時(shí)),加入800 μl Buffer L5,劇烈搖晃離心管35次,再旋渦振蕩30秒混勻。最高速(≥12000 rpm)離心1分鐘。

2. 將步驟1中的離心上清液倒入核酸純化柱中(核酸純化柱置于2 ml離心管中)(步驟1b中的上清液分兩次濾過核酸純化柱),蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

3. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WA,蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

4. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,在核酸純化柱中加入800 μl Buffer WB,蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

5. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,13200 rpm離心2分鐘。

6. 2 ml離心管,將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中,在純化柱的膜中央加入80 μl Buffer TE,蓋上管蓋,室溫靜置2分鐘,12000 rpm離心30秒得到唾液DNA

 

四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 在超微量分光光度計(jì)上用Buffer TE調(diào)零,測量洗脫下來的DNA,結(jié)果如下:

表一

Simgen在超微量分光光度計(jì)上用Buffer TE調(diào)零測量洗脫下來的DNA結(jié)果圖一

表二

Simgen在超微量分光光度計(jì)上用Buffer TE調(diào)零測量洗脫下來的DNA結(jié)果圖二

* 標(biāo)識成藍(lán)色字體的是唾液樣本與唾液DNA保存液混合后在室溫放置不同的時(shí)間提取DNA獲得的數(shù)據(jù)。

 

2. 1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進(jìn)行電泳,結(jié)果如下:

圖一

Simgen在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進(jìn)行電泳結(jié)果圖一

1、2:新鮮采集的唾液立刻提取的DNA

3、4:采集的唾液室溫放置0.5小時(shí)提取的DNA

5、6:采集的唾液室溫放置1小時(shí)提取的DNA

7、8:采集的唾液室溫放置1.5小時(shí)提取的DNA

 

         圖二

Simgen在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進(jìn)行電泳結(jié)果圖二

9、10采集的唾液室溫放置4小時(shí)提取的DNA

11、12采集的唾液混合保存液室溫放置4小時(shí)提取的DNA

13、14:采集的唾液室溫放置7小時(shí)提取的DNA

15、16:采集的唾液混合保存液室溫放置7小時(shí)提取的DNA

17、18:采集的唾液室溫放置24小時(shí)提取的DNA

19、20:采集的唾液混合保存液室溫放置24小時(shí)提取的DNA

  圖三

Simgen在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進(jìn)行電泳結(jié)果圖三Simgen在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進(jìn)行電泳結(jié)果圖四

Marker1 kb DNA Ladder

左圖:唾液采集后與唾液DNA保存液混合后當(dāng)天提取的唾液DNA

右圖:唾液采集后與唾液DNA保存液混合室溫放置一年后提取的唾液DNA

                 

五、 分析與討論

1. 綜合表一和表二的數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn),如果直接取唾液樣本提取DNA,隨著唾液在室溫放置時(shí)間的延長,DNA的提取濃度出現(xiàn)了先增高(0~1小時(shí))后降低(1~24小時(shí))的現(xiàn)象。結(jié)合圖一和圖二的電泳圖我們可以發(fā)現(xiàn),唾液中提取到的DNA均有明顯的凋亡細(xì)胞DNA的特征,即DNA拖尾的帶型與DNA Ladder相似。這就說明了唾液中DNA的主要來源是脫落的口腔上皮細(xì)胞,這些細(xì)胞大多數(shù)已經(jīng)死亡,細(xì)胞核中的染色體結(jié)構(gòu)正處于分崩離析的過程中。

2. 結(jié)合不同時(shí)間段提取的DNA電泳帶型分析,我們發(fā)現(xiàn)唾液樣本直接提取的DNA中大片段DNA(主帶)隨著時(shí)間的延長越來越暗,小片段DNA則亮度先增加(見泳道13,14,室溫存放7小時(shí)達(dá)到最亮)后減少。這說明有一些尚未明確的原因,比如口腔上皮細(xì)胞的自溶過程,或者是唾液中細(xì)菌滋生的一些因素導(dǎo)致唾液收集后其中的大片段DNA一直在持續(xù)地?cái)嗔逊纸獬尚∑?/span>DNA,這些小片段DNA24小時(shí)后大部分都已經(jīng)吸附不到DNA純化柱上了(見泳道17,18)。這個(gè)分解過程在1小時(shí)內(nèi)對提高DNA的提取效率可能是有正向作用的(參考文章提取DNA應(yīng)該粗暴還是溫柔?),但是超過1.5小時(shí)后就能明顯地發(fā)現(xiàn)DNA提取量在迅速地減少。

3. 從表二的數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)唾液與唾液保存液混合后4小時(shí)、7小時(shí)、24小時(shí)后提取到的DNA濃度變化不大,與不加保存液的唾液DNA的提取結(jié)果形成了鮮明對比,驗(yàn)證了唾液DNA保存液對唾液DNA的保存效果。

4. 最后我們可以明確地回答用戶的提問了:唾液樣本收集后,DNA馬上就開始降解了(或者更精確的描述應(yīng)該是上皮細(xì)胞死亡后DNA就開始分解了),所以如果沒有唾液DNA保存液,收集的唾液樣本必須在1小時(shí)內(nèi)放入﹣20℃冰箱或更低溫度冷凍儲藏。室溫存放的唾液DNA降解速度大致情況是4小時(shí)后分解掉50%數(shù)量的DNA24小時(shí)后分解掉90%數(shù)量的DNA。

5. 如果收集的唾液和唾液DNA保存液混合后再存放室溫,提取到的DNA則非常穩(wěn)定,電泳顯示的帶型(見圖二)也沒有明顯的變化。實(shí)際上,我們曾實(shí)測過唾液與唾液DNA保存液混合后室溫放置一年后提取唾液DNA的效果,從電泳上看,一年后提取的DNA帶型與當(dāng)天提取的DNA帶型差別也不是很明顯(見圖三)即唾液樣本經(jīng)唾液DNA保存液處理后能在常溫放置12個(gè)月以上DNA沒有明顯的降解。

 


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