前段時(shí)間有客戶詢問唾液采集后在不加保存液的情況下，唾液中的DNA可以在室溫放多久而不降解。為了解答客戶的疑問，于是小新測試了唾液在室溫放置不同時(shí)間段提取DNA的效果情況，以及唾液與唾液保存液混合后在不同時(shí)間段提取DNA的效果。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

測試唾液樣本在室溫放置不同時(shí)間對唾液DNA的影響及唾液保存液對唾液中DNA的保存效果。

二、實(shí)驗(yàn)材料

1. 新鮮采集的人唾液、1. 5 ml離心管若干、2 ml離心管若干

2. 唾液DNA純化試劑盒（Simgen Cat.No.3501050）、唾液DNA保存液（Simgen Cat.No.3522050）

3. 臺式離心機(jī)（eppendorf centrifuge 5415D）、旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）、超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim-100）、電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）

三、 實(shí)驗(yàn)方法

整個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度波動范圍在22~28℃。

1. 用潔凈的一次性水杯收集唾液：

1a. 轉(zhuǎn)移400 μl唾液到一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中（分別在室溫放置0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、4小時(shí)、7小時(shí)以及24小時(shí)），加入400 μl Buffer L5，劇烈搖晃離心管3－5次，再旋渦振蕩30秒混勻。最高速（≥12000 rpm）離心1分鐘。

1b. 轉(zhuǎn)移400 μl唾液到一個(gè)潔凈的2 ml離心管中，再加入400 μl唾液DNA保存液混合均勻（分別在室溫放置4小時(shí)、7小時(shí)以及24小時(shí)），加入800 μl Buffer L5，劇烈搖晃離心管3－5次，再旋渦振蕩30秒混勻。最高速（≥12000 rpm）離心1分鐘。

2. 將步驟1中的離心上清液倒入核酸純化柱中（核酸純化柱置于2 ml離心管中）（步驟1b中的上清液分兩次濾過核酸純化柱），蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

3. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WA，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

4. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入800 μl Buffer WB，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

5. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，13200 rpm離心2分鐘。

6. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入80 μl Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置2分鐘，12000 rpm離心30秒得到唾液DNA。

四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 在超微量分光光度計(jì)上用Buffer TE調(diào)零，測量洗脫下來的DNA，結(jié)果如下：

表一

表二

* 標(biāo)識成藍(lán)色字體的是唾液樣本與唾液DNA保存液混合后在室溫放置不同的時(shí)間提取DNA獲得的數(shù)據(jù)。

2. 在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的唾液DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果如下：

圖一

1、2：新鮮采集的唾液立刻提取的DNA

3、4：采集的唾液室溫放置0.5小時(shí)提取的DNA

5、6：采集的唾液室溫放置1小時(shí)提取的DNA

7、8：采集的唾液室溫放置1.5小時(shí)提取的DNA

         圖二

9、10：采集的唾液室溫放置4小時(shí)提取的DNA

11、12：采集的唾液混合保存液室溫放置4小時(shí)提取的DNA

13、14：采集的唾液室溫放置7小時(shí)提取的DNA

15、16：采集的唾液混合保存液室溫放置7小時(shí)提取的DNA

17、18：采集的唾液室溫放置24小時(shí)提取的DNA

19、20：采集的唾液混合保存液室溫放置24小時(shí)提取的DNA

  圖三

Marker：1 kb DNA Ladder

左圖：唾液采集后與唾液DNA保存液混合后當(dāng)天提取的唾液DNA

右圖：唾液采集后與唾液DNA保存液混合后室溫放置一年后提取的唾液DNA

五、 分析與討論

1. 綜合表一和表二的數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)，如果直接取唾液樣本提取DNA，隨著唾液在室溫放置時(shí)間的延長，DNA的提取濃度出現(xiàn)了先增高（0~1小時(shí)）后降低（1~24小時(shí)）的現(xiàn)象。結(jié)合圖一和圖二的電泳圖我們可以發(fā)現(xiàn)，唾液中提取到的DNA均有明顯的凋亡細(xì)胞DNA的特征，即DNA拖尾的帶型與DNA Ladder相似。這就說明了唾液中DNA的主要來源是脫落的口腔上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞大多數(shù)已經(jīng)死亡，細(xì)胞核中的染色體結(jié)構(gòu)正處于分崩離析的過程中。

2. 結(jié)合不同時(shí)間段提取的DNA電泳帶型分析，我們發(fā)現(xiàn)唾液樣本直接提取的DNA中大片段DNA（主帶）隨著時(shí)間的延長越來越暗，小片段DNA則亮度先增加（見泳道13,14，室溫存放7小時(shí)達(dá)到最亮）后減少。這說明有一些尚未明確的原因，比如口腔上皮細(xì)胞的自溶過程，或者是唾液中細(xì)菌滋生的一些因素導(dǎo)致唾液收集后其中的大片段DNA一直在持續(xù)地?cái)嗔逊纸獬尚∑?/span>DNA，這些小片段DNA在24小時(shí)后大部分都已經(jīng)吸附不到DNA純化柱上了（見泳道17，18）。這個(gè)分解過程在1小時(shí)內(nèi)對提高DNA的提取效率可能是有正向作用的（參考文章“提取DNA應(yīng)該粗暴還是溫柔？”），但是超過1.5小時(shí)后就能明顯地發(fā)現(xiàn)DNA提取量在迅速地減少。

3. 從表二的數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)唾液與唾液保存液混合后4小時(shí)、7小時(shí)、24小時(shí)后提取到的DNA濃度變化不大，與不加保存液的唾液DNA的提取結(jié)果形成了鮮明對比，驗(yàn)證了唾液DNA保存液對唾液DNA的保存效果。

4. 最后我們可以明確地回答用戶的提問了：唾液樣本收集后，DNA馬上就開始降解了（或者更精確的描述應(yīng)該是上皮細(xì)胞死亡后DNA就開始分解了），所以如果沒有唾液DNA保存液，收集的唾液樣本必須在1小時(shí)內(nèi)放入﹣20℃冰箱或更低溫度冷凍儲藏。室溫存放的唾液DNA降解速度大致情況是4小時(shí)后分解掉50%數(shù)量的DNA，24小時(shí)后分解掉90%數(shù)量的DNA。

5. 如果收集的唾液和唾液DNA保存液混合后再存放在室溫，提取到的DNA則非常穩(wěn)定，電泳顯示的帶型（見圖二）也沒有明顯的變化。實(shí)際上，我們曾實(shí)測過唾液與唾液DNA保存液混合后室溫放置一年后提取唾液DNA的效果，從電泳上看，一年后提取的DNA帶型與當(dāng)天提取的DNA帶型差別也不是很明顯（見圖三），即唾液樣本經(jīng)唾液DNA保存液處理后能在常溫放置12個(gè)月以上而DNA沒有明顯的降解。