做PCR實(shí)驗(yàn)的同學(xué)們都知道，肝素鈉本身是一種PCR的強(qiáng)烈抑制劑，這也是為什么用作DNA提取的血樣都不推薦用肝素抗凝采血管采樣的原因。但是如果一定要從肝素鈉中提取DNA再做PCR檢測(cè)，傳統(tǒng)的酚氯仿抽提加醇沉淀DNA的提取方法肯定只能放棄了，因?yàn)楦嗡氐慕Y(jié)構(gòu)類似多糖，只要是多糖（DNA和脫氧核糖核酸，也有多糖的特性）溶液，加醇后多糖就會(huì)沉淀下來(lái)。但是反過(guò)來(lái)說(shuō)肝素鈉這一多糖特性的好處就是：肝素鈉在提純的過(guò)程中肯定會(huì)殘留較多的DNA，為肝素鈉的物種來(lái)源鑒定提供了最直接的證據(jù)。

最近我們接到一個(gè)肝素鈉物種源性鑒定的需求，收到樣品后才發(fā)現(xiàn)這次的肝素鈉并不是常見(jiàn)的那種黑色的粗品肝素鈉，而是白色粉末狀的精品肝素鈉，這就意味著這個(gè)樣品經(jīng)過(guò)了多次深度加工處理，估計(jì)其中含有的DNA不僅數(shù)量少，而且很可能降解得非常嚴(yán)重了，能不能提取到足夠的DNA用作物種源性檢測(cè)呢？面對(duì)這一棘手樣本，我們拭目以待。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

從精品肝素鈉中提取出DNA，用熒光PCR法鑒定物種源性，并估算DNA含量。 

實(shí)驗(yàn)材料：

兩個(gè)精品肝素鈉樣本，來(lái)自杭州**基因工程有限公司：肝素鈉（批號(hào)：DHS201023 (IL)）；依諾肝素鈉（批號(hào)202004）

肝素鈉DNA純化試劑盒（Simgen Cat.No.7902050）

豬源性DNA熒光PCR檢測(cè)試劑盒（Simgen Cat.No.7804050）

超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）

熒光定量PCR儀（ABI 7500）

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 稱取約200 mg肝素鈉，加入4倍體積（800 μl）的Buffer S，旋渦震蕩直至全部溶解。

2. 在一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中加入500 μl Buffer P5和5 μl Carrier RNA，再加入100 μl步驟1中的肝素鈉溶液，旋渦震蕩混合均勻。

3. 將混合液轉(zhuǎn)移到核酸吸附柱中，離心去濾液。

4. 在核酸吸附柱中加入700 μl Buffer WB，離心去濾液。

5. 最高速（≥12000 rpm）離心1分鐘，棄2 ml離心管。

6. 將核酸吸附柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在吸附柱的膜中央加入100 μl Buffer S，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，離心洗脫DNA。

7. 棄吸附柱，在洗脫的DNA中再次加入500 μl Buffer P5，用移液器吸注數(shù)次混勻Buffer P5和DNA溶液。

8. 將混合液轉(zhuǎn)移到核酸純化柱中，離心棄濾液。

9. 在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WB，離心去濾液。

10. 重復(fù)Buffer WB洗滌一次。

11. 最高速（≥12000 rpm）離心1分鐘，棄2 ml離心管。

12. 將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入50 μl Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，離心洗脫DNA。

13. 按照豬源性DNA熒光PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書配置豬源檢測(cè)PCR反應(yīng)液，加入5 μl提取的DNA和陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

熒光定量PCR擴(kuò)增曲線如下：

1-6是陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果，所含的豬源DNA量依次是5 ng、0.5 ng、0.05 ng、5 pg、0.5 pg、0.05 pg。

7、8是從肝素鈉中提取的DNA的擴(kuò)增結(jié)果。

9、10是從依諾肝素鈉中提取的DNA的擴(kuò)增結(jié)果。

分析與討論：

1. 從熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果分析，提取的兩種肝素鈉樣本的DNA擴(kuò)增均有起線，證明兩種肝素鈉樣本中都含有豬源DNA成分。同時(shí)也說(shuō)明Simgen設(shè)計(jì)的肝素鈉DNA純化試劑盒去除肝素鈉的效果挺好，沒(méi)有抑制PCR擴(kuò)增。

2. 從擴(kuò)增曲線上分析，5 μl肝素鈉提取的DNA含量與5 pg的陽(yáng)性對(duì)照接近重合，5 μl依諾肝素鈉提取的DNA含量在5 pg和0.5 pg的陽(yáng)性對(duì)照之間。

3. 按核酸回收率100%計(jì)算，每20 mg (100 μl 20%肝素鈉溶液)中含豬源DNA為50 pg，即每mg肝素鈉約含豬源DNA 2.5 pg，每mg依諾肝素鈉約含豬源DNA 0.625 pg。這個(gè)數(shù)量級(jí)的DNA含量已經(jīng)屬于痕量級(jí)的DNA了，如果在提取DNA的過(guò)程中未添加Carrier RNA的話，可能回收不到足夠的DNA，也會(huì)使PCR擴(kuò)增失敗。

需要說(shuō)明的是，PCR能擴(kuò)增的DNA片段須大于100 bp，如果肝素鈉在精制的過(guò)程中會(huì)降解DNA，就有可能導(dǎo)致樣本中殘留的一些DNA片段小于100 bp，而這些小片段的DNA則不能作為PCR模板進(jìn)行有效的擴(kuò)增。因此以熒光PCR方法對(duì)精制的肝素鈉樣品中的DNA含量定量分析應(yīng)該不會(huì)太精確，確切地說(shuō)，只能估算片段大于100 bp的DNA分子數(shù)量，其他更小片段的DNA分子則因?yàn)閿U(kuò)增失敗而被忽略了。